Nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện kháng nguyên

1. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học với kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang, chất đánh dấu là các kháng thể được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực tím. Trong phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, muốn phát hiện mỗi kháng nguyên lại cần có một kháng thể huỳnh quang tương ứng.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

+ Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Máy cắt lạnh
- Phiến kính
- Lá kính
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Giá đựng tiêu bản nằm ngang
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút tự động
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Tủ ấm 37 độ.
- Cồn - ete tỷ lệ 1/1.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
- Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Dung dịch glyxerin đệm photphat 1%.
- Kháng thể huỳnh quang.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bệnh phẩm tươi (chưa cố định) được tiến hành cắt lạnh theo qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy 5µm.
- Kháng thể huỳnh quang đã pha theo chuẩn độ, thông thường là 1/80.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được cố định trên phiến kính từ 1-3 giọt kháng thể huỳnh quang, để 30 phút trong một hộp ẩm, kín, ở nhiệt độ 37oC.
- Đổ kháng thể huỳnh quang thừa đi rồi tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Ngâm bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2 trong 30 phút x 2 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glyxerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.
Ví dụ: Muốn phát hiện virut dại trong bệnh phẩm mô não người hoặc não súc vật, lấy bệnh phẩm làm phiến đồ hoặc làm các mảnh cắt lạnh và cố định cồn + ete hoặc bằng aceton.
- Nhỏ lên phiến kính một giọt globulin của kháng huyết thanh kháng virut dại đã đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Trường hợp dương tính, sẽ thấy rõ các tiểu thể Negri trong tế bào thần kinh bắt huỳnh quang màu xanh lục.

4. ĐỌC KẾT QUẢ

Kháng nguyên cần phát hiện có màu xanh lục.