1. NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm lai tại chỗ sử dụng mồi dò DNA gắn digoxigenin gắn chất mầu diaminobenzidin (DAB) nhằm xác định tình trạng khuyếch đại gen Her-2/neu.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
- Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
- Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01
2.2. Phương tiện, hóa chất
2.2.1. Phương tiện
+ Máy lai biến tính
+ Kính hiển vi quang học
+ Phiến kính, lá kính
+ Máy cắt lát mỏng
+ Lưỡi dao cắt lát mỏng
+ Tủ ấm 37o và 56o
+ Tủ lạnh
+ Ống hút
2.2.2. Hóa chất
+ Ezprep khử parafin
+ Dung dịch CC2 khử parafin
+ Proteaza
+ Nước bạc
+ Dung dịch SIL ISH DNP CHRC
+ RED ISH DIG FR
+ RED ISH DIG FR
+Thuốc nhuộm hematoxylin
+ Dung dịch Bluing
+ Bộ kít Her-2 và CEP17
+ Cồn (70o, 80o, 85o, 90o, 100o).
+ Xylen
+ Dung dịch rửa
3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
- Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan
- Cài đặt chương trình cho máy
- Dán nhãn và đặt phiến kính gắn mẫu mô đã cắt vào máy
- Khử parafin bằng EZprep
- Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 90oC
- Xử lý proteaza: 16 phút
- Ủ mảnh cắt với 100 µl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút
- Biến tính DNA trong 20 phút ở 80oC
- Lai DNA trong 6 giờ ở 37oC
- Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 72oC
- Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC: 4 phút
- Ủ với RED ISH DIG FR: 24 phút
- Ủ với RED ISH DIG FR: 8 phút
- Nhuộm hematoxylin II trong 4 phút
- Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút
- Lấy mảnh cắt ra khỏi máy và làm sạch mảnh cắt
- Làm khô mảnh cắt trong 1 giờ ở 60oC
- Ngâm mảnh cắt trong xylen 3 phút x 2 lần
- Gắn lá kính và đọc kết quả.
4. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Đánh giá tỷ lệ Her-2/CEP17 bằng cách đếm tín hiệu Her-2 (màu đỏ) và tín hiệu NST17 (màu nâu vàng) trong 20 nhân tế bào ung thư xâm nhập.
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
+ Tỷ lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
+ Tỷ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên, cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.
Số lượng tín hiệu màu đỏ sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.
5. NHỮNG VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHÁC PHỤC
KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU | |
NGUYÊN NHÂN | CÁCH KHẮC PHỤC |
Khử parafin không hết | Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế EZREP mới |
Điều kiện lai không chính xác | Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai |
Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác | Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai |
Có bóng khí khi gắn lá kính | Loại bỏ bóng khí trƣớc khi đƣa vào máy lai |
Không đủ dung dịch lai hoặc probe | Tăng thêm lƣợng probe |
Digest không đủ | Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest |
Thời gian cố định quá dài | Kiểm tra lại qui trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 - 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ |
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM | |
NGUYÊN NHÂN | CÁCH KHẮC PHỤC |
Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm | Tăng thêm thời gian cố định |
Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí | Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí |
Kích thước bệnh phẩm quá lớn | Tăng thể tích dung dịch lai |
NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND) | |
NGUYÊN NHÂN | CÁCH KHẮC PHỤC |
Do quá trình rửa sau khi lai | Kiểm tra lại pH của dung dich rửa (7.2-7.5) Kiểm tra lại nhiêt độ buồng rửa Lắc trong quá trình rửa Tăng thời gian rửa bằng SSC lên 5 phút Tăng thời gian rửa nghiêm ngặt sau lai Điều chỉnh thời gian nhuộm bằng H&E và Bluing |
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM | |
NGUYÊN NHÂN | CÁCH KHẮC PHỤC |
Sấy tiêu bản không đúng | Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56oC) |
Bộc lộ quá mức | Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ Giảm thời gian bộc lộ Giảm thời gian digest |
Biến tính quá mức | Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính Giảm thời gian biến tính |
Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai | Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dich rửa và lắc đều |
- Đăng nhập để gửi ý kiến
