Kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang (fish)

1. NGUYÊN LÝ

Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH) sử dụng mồi dò DNA gắn huỳnh quang để xác định khuyếch đại gen Her-2/neu.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
- Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
- Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01

2.2. Phương tiện, hóa chất

2.2.1 Phương tiện

+ Máy ThermoBrite
+ Kính hiển vi huỳnh quang
+ Phiến kính, lá kính
+ Máy cắt lát mỏng
+ Lưỡi dao cắt lát mỏng
+ Tủ ấm 37o và 56o
+ Tủ lạnh
+ Ống hút

2.2.2. Hóa chất

+ Bộ kít PathVysion
+ Cồn (70o, 80o, 85o, 90o, 100o).
+ Xylen
+ Dung dịch rửa

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

3.1. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan.
- Các mảnh cắt được ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC.
- Đánh dấu vùng tế bào u xâm lấn bằng bút viết kính.

3.2. Khử parafin của mảnh cắt

- Nhúng các mảnh cắt vào xylen 3 lần, mỗi lần 5 phút
- Khử nước bằng cồn 90 độ, 2 lần, mỗi lần 5 phút
- Làm khô các mảnh cắt ở 45oC: 2-5 phút
- Rửa nước cất 1 lần: 3 phút
- Rửa các mảnh cắt bằng dung dịch đệm 1 lần: 3 phút
- Nhúng trong dung dịch đệm nhiệt độ 80oC: 30 phút
- Rửa nước cất 1 lần: 1 phút
- Rửa bằng dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng 2 lần, mỗi lần 5 phút

3.3. Xử lý proteaza

- Các mảnh cắt được lau khô các vùng nước đọng
- Ngâm trong dung dịch proteaza: 10-60 phút ở nhiệt độ 37o C
- Rửa bằng dung dịch đệm 2 lần, mỗi lần 5 phút
- Làm khô ở 45oC: 2-5 phút

3.4. Khử nước

- Cồn 70o: 1 phút, nhiệt độ phòng
- Cồn 85o: 1 phút, nhiệt độ phòng
- Cồn 100o: 1 phút, nhiệt độ phòng
- Làm khô ở 45oC: 2-5 phút

3.5. Tách DNA và lai đồng thời

- Dùng máy ThermoBite, thực hiện công đoạn trong buồng tối
- Làm ấm lọ chứa đoạn đầu dò bằng máy lắc
- Lấy 5 µl đoạn dò, nhỏ lên vùng ung thư xâm nhập đã được đánh dấu
- Gắn lá kính kích thước 22 mm x 22 mm, phủ mép lá kính bằng nhựa cao su
- Kích hoạt chương trình của máy
- Tách DNA ở 75oC: 5 phút
- Lai đoạn dò DNA đích ở 37oC: 18 giờ, đảm bảo buồng lai tối
- Tạo môi trường ấm, đậy nắp
- Rửa sau khi lai (thực hiện trong buồng tối)
- Làm nóng dung dịch rửa sau lai ở 72oC
- Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phòng
- Nhúng các mảnh cắt vào lọ dung dịch sau lai ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ để lá kính rời ra.
- Lau những giọt nước đọng trên các phiến kính.
- Nhúng vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ 72oC: 2 phút
- Lau khô trong buồng tối

3.6. Nhuộm màu tương phản nhân

- Nhỏ 5 µl DAPI vào vùng đã chọn
- Dán lá kính

3.7. Khảo sát tiêu bản

- Bảo quản tiêu bản vào hộp giấy bạc, giữ ở -20oC, ít nhất 30 phút trước khi quan sát
- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều kính lọc các bước huỳnh quang.

4. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Đánh giá kết quả dựa vào tỷ lệ tín hiệu màu vàng (gen Her-2/neu) và tín hiệu màu xanh (nhiễm sắc thể 17).
Đếm tín hiệu trên 20 nhân tế bào u xâm nhập, các nhân tế bào được đếm phải tách rời, không chồng lên nhau.
- Tỷ lệ Her-2/NST17 < 1,8: không khuyếch đại
- Tỷ lệ Her-2/NST17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
- Tỷ lệ 2,5 < Tỷ lệ Her-2/NST17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
- Tỷ lệ Her-2/NST17 > 5: khuyếch đại cao
- 1,8 ≤ Tỷ lệ Her-2/NST17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.
Số lượng tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.

5. NHỮNG VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHÁC PHỤC