Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng thể

1. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học và kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang, chất đánh dấu là các kháng nguyên được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực tím. Trong phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, trên các mảnh cắt là các kháng nguyên đã biết. Nhỏ lên các mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh (đã pha loãng theo yêu cầu của từng trường hợp chẩn đoán). Nếu trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở các mảnh cắt thì phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành. Phức hợp này có thể phát hiện được nếu nhỏ lên trên đó một giọt globulin kháng globulin huỳnh quang (kháng người). Vì vậy, khi kháng nguyên bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

+ Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Máy cắt lạnh
- Phiến kính
- Lá kính
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Giá đựng tiêu bản nằm ngang
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút tự động
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Tủ ấm 37 độ.
- Cồn - ete tỷ lệ 1/1.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
- Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Dung dịch glycerin đệm photphat 1%.
- Huyết thanh người bệnh.
- Globulin kháng globulin gắn huỳnh quang.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bệnh phẩm tươi (chưa cố định) được tiến hành cắt lạnh theo qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy 5µm.
- Ly tâm máu Người bệnh lấy huyết thanh.
- Nhỏ lên trên các mảnh cắt đã được cố định trên các phiến kính từ 1 đến 3 giọt huyết thanh, để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ huyết thanh thừa đi, tráng kỹ nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Ngâm 30 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên các mảnh cắt một giọt kháng globulin huỳnh quang để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ globulin - kháng globulin huỳnh quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm 10 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glyxerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.

4. ĐỌC KẾT QUẢ

Kháng thể cần phát hiện có màu xanh lá cây.