Nhuộm grocott

1. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật này dùng để phát hiện nấm, pneumocystis carinii dựa theo nguyên lý kỹ thuật Gomori trong bạc - methenamine. Nguyên lý chung của phản ứng gần giống với nguyên lý trong phản ứng PAS: nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng axit chromic hoặc permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc - methenamine.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

2.2.1. Phương tiện, hóa chất chung

2.2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): Dung dịch bạc - methenamin, dung dịch xang lá cây sáng (Vert lumière) SF, dung dịch nước hàn the (borax), axit acetic đậm đặc, dung dịch chlorua vàng.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

3.1. Cố định

Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

3.2. Chuyển bệnh phẩm

3.3. Vùi parafin

3.4. Đúc khối parafin

3.5. Cắt và dán mảnh cắt

3.6. Nhuộm mảnh cắt

3.6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm

a. Dung dịch bạc - methenamin

* Dung dịch mẹ

Chú ý: cho từ từ bạc nitrate vào hexamethylen tetramin sẽ được một tủa trắng. Ngay sau đó, tủa này tự hòa tan. Có thể bảo quản dịch ở tủ lạnh trong nhiều ngày.

* Dung dịch pha trước khi dùng:

b. Dung dịch xanh lá cây sáng

* Dung dịch mẹ

* Dung dịch pha trước khi dùng

3.6.2. Tiến hành kỹ thuật

1. Các mảnh cắt được tẩy parafin qua 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa trong nước cất 3- 5 phút
4. Oxy hóa trong dung dịch axit chromic 5% trong 1giờ
5. Rửa nước chảy 2 - 3 phút
6. Rửa trong dung dịch bisunfit Na 1% trong 1phút
7. Rửa qua nước chảy: 5 - 10 phút
8. Rửa trong 3 - 4 bể nước cất: mỗi bể 5 lần nhúng
9. Ngâm trong dung dịch bạc - methenamin ở nhiệt độ 58º khoảng 30 - 60 phút cho đến khi mảnh cắt có màu vàng nâu
10. Lấy mảnh cắt ra, ngâm trong nước cất. Kiểm tra màu sắc dưới kính hiển vi.
11. Rửa trong 6 bể nước liên tiếp, mỗi bể 5 lần nhúng.
12. Thúc trong dung dịch chlorua vàng trong 2 - 5 phút
13. Rửa trong nước cất
14. Loại bỏ bạc thừa bằng dung dịch hyposunfit Na 2% trong 2 - 5 phút
15. Rửa nước thật kỹ
16. Nhuộm nền bằng xanh lá cây sáng: 30 - 50 giây
17. Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
18. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
19. Gắn lá kính bằng dung dịch nhựa tổng hợp

4. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

- Nấm: màu nâu đen - đen
- Chất nền: xanh nhạt
- Chất nhầy: màu ghi đậm

5. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ

Dung dịch bạc - methenamin là chất oxy hóa có độc tính cao, do đó khi tiếp xúc với dung dịch phải rất cẩn thận, phải đeo khẩu trang, găng tay và phải ở nơi thoáng gió. Có thể giữ dung dịch ở 4°C trong vài tháng.
Khi nhuộm, cần có mảnh cắt chứng đã có thành phần nấm dương tính với phẩm nhuộm này. Nếu mảnh cắt âm tính giả, nên kiểm tra hạn dùng của dung dịch bạc - methenamin để thay dung dịch mới hoặc để thời gian nhuộm lâu hơn.
Trong bước 9 của qui trình nhuộm, dung dịch methenamin được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng và cần hâm nóng đến 58°C bằng cách nhanh nhất, mảnh cắt sẽ được tráng màu nâu vàng bằng dung dịch bạc - methenamin và được kiểm tra mức độ bắt màu.