Kỹ thuật kháng bổ thể huỳnh quang phát hiện kháng thể

1. NGUYÊN LÝ

Các mảnh cắt chứa kháng nguyên đã biết, nhỏ lên các mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh (đã làm mất hoạt tính) và một giọt bổ thể (huyết thanh tươi của chuột lang). Nếu trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở các mảnh cắt thì sẽ hình thành một phức hợp kháng nguyên - kháng thể - bổ thể. Phức hợp này có thể phát hiện bằng một kháng thể huỳnh quang (globulin kháng globulin chuột lang đã được đánh dấu), khi có hiện tượng huỳnh quang là phản ứng dương tính (chỉ áp dụng được phương pháp này trong việc phát hiện những kháng thể có khả năng kết hợp bổ thể mà thôi).

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

+ Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Máy ly tâm
- Máy cắt lạnh
- Phiến kính
- Lá kính
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Giá đựng tiêu bản nằm ngang
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút tự động
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Tủ ấm 37 độ.
- Cồn - ete tỷ lệ 1/1.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
- Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Dung dịch glyxerin đệm photphat 1%.
- Huyết thanh Người bệnh đã làm mất hoạt tính.
- Bổ thể (huyết thanh tươi của chuột lang)
- Globulin kháng globulin chuột lang đã được gắn huỳnh quang.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bệnh phẩm tươi có kháng nguyên đã biết (không cố định).
- Cắt bệnh phẩm bằng máy cắt lạnh thành các lát mỏng có độ dầy 5µm theo qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Ly tâm máu Người bệnh lấy huyết thanh.
- Nhỏ lên trên các mảnh cắt đã cố định trên các phiến kính 1 giọt huyết thanh (đã làm mất hoạt tính) để 30 phút trong hộp ẩm ở 370C.
- Đổ huyết thanh thừa đi, tráng kỹ nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Ngâm 30 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên các mảnh cắt một giọt bổ thể để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ kháng nguyên- bổ thể thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm 10 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Nhỏ lên trên các mảnh cắt 1 giọt globulin kháng globulin chuột lang gắn huỳnh quang, để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ globulin kháng globulin chuột lang gắn huỳnh quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm 10 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glyxerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.

4. ĐỌC KẾT QUẢ

Kháng thể cần phát hiện có màu xanh lá cây.