Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên

1. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học với kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang, chất đánh dấu là các kháng thể được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực tím. Trong phương pháp gián tiếp, chỉ cần một số kháng thể huỳnh quang đặc hiệu đối với từng loại để phát hiện tất cả những kháng nguyên khác nhau, nhưng do cường độ huỳnh quang đặc hiệu thường lớn hơn, có thể phát hiện được cả những phần tử kháng nguyên rất nhỏ.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

+ Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Máy cắt lạnh
- Phiến kính
- Lá kính
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Giá đựng tiêu bản nằm ngang
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút tự động
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Tủ ấm 37 độ.
- Cồn - ete tỷ lệ 1/1.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
- Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Dung dịch glycerin đệm photphat 1%.
- Kháng huyết thanh.
- Kháng kháng thể huỳnh quang

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bệnh phẩm tươi (chưa cố định) được tiến hành cắt lạnh theo qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy 5µm.
- Kháng huyết thanh đã pha theo chuẩn độ, thông thường là 1/80.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được cố định trên phiến kính 1-3 giọt kháng huyết thanh, để 30 phút trong một hộp ẩm, kín, ở nhiệt độ 37oC.
- Đổ huyết thanh thừa đi rồi tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Ngâm bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2 trong 30 phút x 2 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt kháng kháng thể huỳnh quang, để 30 phút trong hộp ẩm ở 37 độ C.
- Đổ kháng kháng thể huỳnh quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2 trong 10 phút x 2 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường, khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glyxerin đệm photphat. Đậy lá kính. Gắn rìa lá kính vào phiến kính bằng parafin.
Thí dụ: Muốn phát hiện các tế bào ung thư của ung thư nguyên bào nuôi trong bệnh phẩm nạo buồng tử cung, lấy bệnh phẩm làm phiến đồ hoặc làm các mảnh cắt lạnh, cố định bằng cồn-ete hoặc bằng aceton lạnh trong 30 phút.
- Nhỏ lên mảnh cắt một giọt kháng huyết thanh kháng ung thư biểu mô màng đệm (ví dụ: huyết thanh của thỏ đã được miễn dịch với các tế bào ung thư). Phức hợp kháng nguyên kháng thể (không huỳnh quang) được hình thành. Sau đó nhỏ lên các mảnh cắt một giọt globulin - kháng globulin thỏ đã đánh dấu (kháng kháng thể huỳnh quang), kháng kháng thể huỳnh quang sẽ kết hợp đặc hiệu với globulin của huyết thanh thỏ và phức hợp kháng nguyên - kháng thể - kháng kháng thể huỳnh quang được hình thành.
Trong trường hợp dương tính, sẽ thấy rõ các tế bào ung thư bắt huỳnh quang màu xanh lá cây.

4. ĐỌC KẾT QUẢ

Kháng nguyên cần phát hiện có màu xanh lá cây.