Kỹ thuật ức chế huỳnh quang phát hiện kháng thể

1. NGUYÊN LÝ

Nhỏ lên trên mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh (đã được pha loãng theo yêu cầu của từng trường hợp chẩn đoán). Nếu trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở mảnh cắt thì phức hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành, tức là kháng thể đã tiếp cận với kháng nguyên. Sau đó, nếu nhỏ lên một giọt kháng thể đánh dấu thuốc nhuộm huỳnh quang tương ứng với kháng nguyên của mảnh cắt thì kháng thể này không còn chỗ để kết hợp với kháng nguyên nữa, vì các vị trí tiếp nhận của kháng nguyên đã bị chiếm lĩnh. Vì vậy, khi kháng nguyên không bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

+ Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Máy cắt lạnh
- Phiến kính
- Lá kính
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Giá đựng tiêu bản nằm ngang
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút tự động
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Tủ ấm 37 độ.
- Cồn - ete tỷ lệ 1/1.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
- Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Dung dịch glyxerin đệm photphat 1%.
- Huyết thanh Người bệnh.
- Kháng thể kháng kháng nguyên gắn huỳnh quang.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bệnh phẩm tươi có kháng nguyên đã biết (không cố định).
- Cắt bệnh phẩm bằng máy cắt lạnh thành các lát mỏng có độ dầy 5µm theo qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Ly tâm máu Người bệnh lấy huyết thanh.
- Nhỏ lên trên các mảnh cắt đã cố định trên các phiến kính từ 1 đến 3 giọt huyết thanh, để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ huyết thanh thừa đi, tráng kỹ nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
- Ngâm 30 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên các mảnh cắt một giọt kháng thể kháng kháng nguyên gắn huỳnh quang để 30 phút trong hộp ẩm ở 37oC.
- Đổ kháng thể kháng kháng nguyên gắn huỳnh quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm 10 phút trong dung dịch đệm photphat pH 7,2, thay đổi hai lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glyxerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.

4. ĐỌC KẾT QUẢ

Khi kháng nguyên không bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người bệnh có kháng thể.