1. NGUYÊN LÝ
Tế bào tủy là những tế bào non có khả năng phân bào. Do đó người ta có thể sử dụng thu hoạch trực tiếp hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo mà không cần chất kích thích non hóa. Sau đó dùng chất ức chế phân bào ức chế tế bào ở kỳ giữa của quá trình phân bào lúc này nhiễm sắc thể có hình dạng điển hình nhất, thu hoạch rồi chuẩn bị tiêu bản phân tích cụm nhiễm sắc thể.
2. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính.
3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
4. CHUẨN BỊ
4.1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật.
4.2. Phương tiện - Hóa chất
4.2.1. Phương tiện
- Ống falcon 50 ml vô trùng;
- Chai nuôi cấy vô trùng;
- Bộ dụng cụ đếm bạch cầu;
- Lam kính;
- Giá để lam;
- Ống falcon 15 ml;
- Ống nghiệm thủy tinh;
- Pipet Pasteur;
- Ống eppendorf;
- Ống chứa chất chống đông heparin sodium 5ml.
4.2.2. Hóa chất
- Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L-glutamin, Hepes);
- Huyết thanh bào thai bê (FBS);
- Dung dịch ức chế phân bào (Colcemide 0,01 ‰ (10µg/ml));
- Dung dịch nhược trương(KCL 0,075M (pH = 7,4);
- Dung dịch đếm bạch cầu;
- Methanol tuyệt đối;
- Acid acetic;
- Kháng sinh (Streptomicin 10mg/ml + Penecilin 10,000UI/ml).
4.3. Bệnh phẩm
2ml tủy được chứa trong ống có chất chống đông heparin sodium.
5. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
5.1. Nuôi cấy
5.1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5ml huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều.
5.1.2. Đếm số lượng tế bào
- Ly tâm 1.000 vòng/phút trong 8 phút lấy lớp buffy coat cho vào 3ml môi trường trộn đều và đếm số lượng tế bào tủy trong hỗn dịch.
- Tính toán số lượng tế bào cho vào mỗi chai nuôi cấy sao cho số lượng tế bào đạt từ 1- 4x106 tế bào/ml môi trường nuôi cấy.
5.1.3. Chuẩn bị chai nuôi cấy
- Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch.
- Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
5.1.4. Nuôi cấy tế bào
Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị. Lắc nhẹ cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC, 5% CO2/24 giờ.
5.2. Thu hoạch
5.2.1. Nhỏ colcemide:
Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 l dung dịch colcemide 0.010/00 (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.
5.2.2. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml/mẫu)
- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol: 1 acid acetic
- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy.
5.2.3. Chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.
5.2.4. Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).
5.2.5. Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37oC vào ống ly tâm, trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37oC trong 18 phút.
5.2.6. Sau khi ủ 18 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5-1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5-10 phút.
5.2.7. Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
5.2.8. Lặp lại bước 7 đến khi cặn tế bào trắng. Tái huyền dịch bằng carnoy.
5.3. Nhỏ tiêu bản
- Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô.
- Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để nghiêng 20 - 30o trên giấy thấm.
- Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm.
- Để tiêu bản khô tự nhiên trước khi nhuộm.
Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ thêm tiêu bản khi cần.
5.4. Nhuộm Giêmsa
- Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ;
- Nhuộm tiêu bản 5-10 phút;
- Rửa dưới vòi nước;
- Sấy khô trong tủ sấy 60oC.
6. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
6.1. Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và băng G, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
6.2. Một số quy tắc trong khi phân tích:
- Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm kỳ giữa trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
- Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm kỳ giữa trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.
- Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường.
7. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Margaret J. Barch, (1991), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”, Raven press.
2. Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Cấy máu ngoại vi phân tích nhiễm sắc thể”, “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học, pp103-110.
- Đăng nhập để gửi ý kiến
