Nhuộm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương (Immunohisto Chemical stain on bone marrow biopsy)

1. NGUYÊN LÝ

Nhuộm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương là phương pháp nhuộm sử dụng các kháng thể đã biết để xác định kháng nguyên có trong tổ chức tủy xương. Đây là kỹ thuật kết hợp phản ứng miễn dịch và hóa chất để làm hiện rõ các kháng nguyên hiện diện trong tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân tế bào).

2. CHỈ ĐỊNH

- Nghi ngờ u lympho xâm lấn tủy xương; 
- Nghi ngờ K di căn tủy xương; 
- Nghi ngờ tăng sinh bất thường các dòng tế bào trong tủy xương.

3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

4. CHUẨN BỊ

4.1. Người thực hiện

01 kỹ thuật viên hoặc cử nhân kỹ thuật chuyên khoa Huyết học - Truyền máu.

4.2. Phương tiện - Hóa chất

4.2.1. Dụng cụ

- Kính hiển vi quang học; 
- Máy cắt tiêu bản; 
- Bàn sấy 37oC; 
- Lam kính chuyên dụng POLYSINED SNIDE; 
- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 100ml: 07 chiếc; 
- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 200ml: 07 chiếc; 
- Lò vi sóng: 01 chiếc; 
- Giá cài tiêu bản vừa bể nhuộm 200ml: 01 chiếc; 
- Giá gỗ cài tiêu bản: 02 chiếc; 
- Pipette man 0.2 -10 l: 01 chiếc; 
- Pipette man 100 l: 01 chiếc; 
- Ống nghiệm vô trùng 2ml: 10 ống (tùy số maker cần sử dụng)
- Khay Inox 30 x 50 cm: 02 chiếc; 
- Gạc thấm nước: 03 chiếc; 
- Bút chì: 01 chiếc; 
- Lamen 22 x 24 hoặc 22 x 22.

4.2.2. Hóa chất

- Toluen 1, 2, 3: để sẵn trong 3 bể nhuộm 100ml; 
- Cồn Etylic 80o, cồn tuyệt đối 1,2 để sẵn trong bể nhuộm 100ml; 
- Dung dịch đệm TBS (pH = 7,6); 
- Dung dịch đệm Citrat Buffer (pH = 7,0); 
- Dung dịch HydroClorit (oxy già) 3%; 
- Dung dịch Anti Dako Diluent; 
- Kháng thể 1 (Anti Human - Tùy từng Marker); 
- Kháng thể 2 (Envision + HRP - REF: K5007); 
- Bộ định màu DAB + Chomogen (REF: K5007); 
- Dung dịch Hematoxylin 5% 100ml; 
- Boom Canada: Lấy ra cốc nhỏ, để trong tủ 60oC.

4.2.3. Pha hóa chất

a) Dung dịch TBS (pH = 7.6)

* Dung dịch Tris HCL (1)

* Dung dịch NaCl (2)

 Dung dịch TBS gồm: 100 ml (1) + 100 ml (2) + 800ml nước cất = 1000 ml chuẩn độ để đạt pH = 7,6.

2.3.2. Dung dịch Citrat buffer pH = 7.0

*Dung dịch (A): 

* Dung dịch (B), pH = 6.0

 Citrat buffer gồm: 2ml (A) + 98ml (B) + 900ml nước cất(1000ml)

b) Dung dịch kháng thể 1

Là sự kết hợp của Anti Diluent (100µl/1 tiêu bản) với kháng thể đã biết (Anti Human) theo tỷ lệ khuyến cáo của nhà sản xuất và tùy từng maker sử dụng.

4.3. Bệnh phẩm

Lốc nến mảnh sinh thiết tủy xương.

4.4. Phiếu xét nghiệm

5. Các bước tiến hành

5.1. Chuẩn bị tiêu bản

- Đúc khuôn parafin mảnh sinh thiết tủy xương đã được xử lý, làm nguội và để trong tủ lạnh 2-8oC.
- Cắt tiêu bản mỏng 0,2 m, dán trên lam kính chuyên dụng.
- Sấy khô tiêu bản trong tủ ấm 37oC trong thời gian 12 giờ.

5.2. Tiến hành nhuộm

Thực hiện theo quy trình sau ở điều kiện tiêu bản luôn ẩm: 
- Ngâm tiêu bản trong dung dịch Toluen (15 phút), cồn 80o (5 phút) và cồn tuyệt đối (10 phút).
- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút.
- Tráng tiêu bản qua dd TBS (pH = 7,6) trong vài giây  Cho vào đệm Citratebuffer (pH = 7.0) và đun trong lò vi sóng: 15 phút (ở chế độ M.Hight).
- Để nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng đến ≤ 40oC.
- Rửa bằng dd TBS (pH = 7,6): 3 lần (lần đầu tráng qua, lần 2 & 3 mỗi lần 5 phút).
- Ngâm trong dung dịch Oxy (Hydrogen peoxide) già 3%: 3 phút
- Tráng qua nước cất 2 lần (dùng bình bóp).
- Cho qua dung dịch TBS (pH = 7,6): 3 lần
- Cho tiêu bản ra giá và ủ kháng thể 1(100 - 200l/lam): 30 phút.
- Rửa bằng dung dịch TBS (pH = 7,6): 3 lần, lau khô xung quanh mảnh.
- Phủ kháng thể 2 (Envision + HRP): 30 phút.
- Rửa bằng dung dịch TBS (pH = 7,6): 3 lần, lau khô xung quanh mảnh.
- Phủ dung dịch DAB (Tỷ lệ: 1ml buffer + 10 l chomogen): 5 - 10 giây, kết thúc ở 5 phút.
- Rửa qua nước cất 2 bằng bình bóp rồi cài vào giá trong bể nhuộm có sẵn nước cất 2 lần.
- Nhuộm Hematoxylin: 1 phút.
- Tráng cồn tuyệt đối, ngâm tiêu bản trong Toluen  gắn lamen, để khô và nhận định kết quả.

6. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Việc nhận định kết quả hình thái được khẳng định ở hai tiêu chí: âm tính và dương tính.
Âm tính: Trên kính hiển vi quan sát thấy nhân của các tế bào bắt màu xanh tím của Hematoxylin, nguyên sinh chất không có biểu hiện gì.
Dương tính: Nếu có sự hiện diện kháng nguyên trên tế bào, phức hợp kháng nguyên - kháng thể - DAB Chromogen sẽ cho màu vàng nâu trên nguyên sinh chất của tế bào, nhân của tế bào bắt màu xanh tím của Hematoxylin.

7. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Để lam khô trong quá trình nhuộm; 
- Thực hiện không đầy đủ theo quy trình kỹ thuật; 
- Xử lý mảnh sinh thiết không tốt; 
- Thời gian nhuộm các bước không phù hợp; 
- Kỹ năng của người thực hiện kỹ thuật chưa ổn định.